類器官，是指用來自胚胎、細(xì)胞重編程誘導(dǎo)、人體或動(dòng)物組織的干細(xì)胞/祖細(xì)胞，在體外經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化后，自我組裝生成具有特定器官的細(xì)胞譜系構(gòu)成、可模擬在體動(dòng)物臟器的一些基本功能活動(dòng)特征的三維結(jié)構(gòu)細(xì)胞簇，屬于體外細(xì)胞模型的范疇[1]。

       2009年，荷蘭科學(xué)家Hans Clevers團(tuán)隊(duì)首次利用表達(dá)富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5, Lgr5)的小鼠腸道干細(xì)胞在體外培養(yǎng)出具有隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸組織，標(biāo)志著類器官技術(shù)正式誕生[2]。此后，包括腸道[3]、結(jié)腸[4]、視網(wǎng)膜[5]、甲狀腺[6]、胰腺[7]、大腦[8]、食道[9]、前列腺[10]、胃[11]、肝臟[12-13]、腎臟[14]、輸卵管[15]、唾液腺[16]、子宮內(nèi)膜[17-18]、乳腺[19]、肺[20]、血管[21]、皮膚[22]、心臟[23]等，數(shù)十種人類器官相繼開發(fā)問世，引起了科學(xué)、產(chǎn)業(yè)界的極大關(guān)注。

       類器官實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法的成功探索，被視作推進(jìn)生物學(xué)研究的重大突破，先被Nature Methods評(píng)為2017年度技術(shù)，登上2019年Science雜質(zhì)的封面，還被《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（The New England Journal of Medicine，NEJM）評(píng)為優(yōu)良的人類臨床前疾病模型。 

一、類器官相關(guān)技術(shù)研究應(yīng)用基本現(xiàn)狀

       與常規(guī)2D 細(xì)胞培養(yǎng)物比，類器官具有真實(shí)器官類似的細(xì)胞組成、結(jié)構(gòu)和部分功能活動(dòng)，可還原體內(nèi)細(xì)胞分化與細(xì)胞遷移，以及細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)復(fù)雜的相互作用。類器官的形成過程本身即是對(duì)組織器官真實(shí)發(fā)育過程的模擬。因此，類器官為科學(xué)家理解組織器官發(fā)生、早期發(fā)育等關(guān)鍵問題打開了一扇新的窗戶。研究人員用大腦類器官構(gòu)建了人類大腦發(fā)育的多組學(xué)圖譜，揭示了人腦早期發(fā)育過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[24]；而依托人類干細(xì)胞構(gòu)建的囊胚、原腸胚等早期胚胎類器官，人們可直觀地觀察到胚胎的整體構(gòu)造和早期發(fā)育過程，揭開了人類胚胎發(fā)育階段的 “盲盒”[25]。

       在疾病致病機(jī)理研究方面，通過干細(xì)胞受控定向分化、基因編輯方法，類器官技術(shù)有望解決疾病模型缺乏、動(dòng)物建模難題，為人類特有的、罕見病、遺傳性疾病、癌癥和傳染病等疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制等研究、探索新治療靶點(diǎn)和新療法提供了全新機(jī)遇。譬如，SARS-CoV-2重度感染者除呼吸癥狀，代謝、心臟、神經(jīng)、腸胃系統(tǒng)并發(fā)癥的出現(xiàn)也困擾著醫(yī)學(xué)界。為驗(yàn)證SARS-CoV-2對(duì)除肺部以外其他器官的靶向性和并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制，研究人員就用各種類器官模型開展了模擬感染的實(shí)驗(yàn)研究[26]。

       采用患者自身組織細(xì)胞分離的干細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)和定向分化可生成的與患者器官表型相同的類器官。類器官技術(shù)與與CRISPR-Case9基因組編輯技術(shù)相結(jié)合，可進(jìn)行患者有缺陷的基因而提供“健康基因”表型的類器官，作為再生醫(yī)學(xué)(regenerative medicine)生物材料來源，進(jìn)行自體移植，可有效規(guī)避免疫排斥反應(yīng)和規(guī)避致瘤性（Oncogenicity）風(fēng)險(xiǎn)。目前已從小鼠和人類多能干細(xì)胞中重建了三維腎小管和腎小球，有望將為尿毒癥晚期患者實(shí)施腎移植方案所需的腎臟來源障礙開辟了一條全新途徑。而在個(gè)性化醫(yī)療（Personalized medicine）模式背景下，患者來源的類器官（Patient Derived Organoid，PDO）作為先進(jìn)療法藥品（Advanced Therapy Medicinal Products, ATMP），正越來越多地被用作為病人量身設(shè)計(jì)最佳治療方案的工具[1]。

       生成類器官所用的各種干細(xì)胞材料可長(zhǎng)期穩(wěn)定儲(chǔ)存、培養(yǎng)、傳代和擴(kuò)增，且實(shí)驗(yàn)條件、操作流程易于標(biāo)準(zhǔn)化。細(xì)胞材料遺傳背景可長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，確保類器官的生產(chǎn)的穩(wěn)定性、可持續(xù)性和高通量的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，研究人員能實(shí)時(shí)直觀簡(jiǎn)便觀察類器官及細(xì)胞內(nèi)部動(dòng)態(tài)、微妙變化。作為藥物發(fā)現(xiàn)和篩選平臺(tái)，類器官避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人體的種屬差異，能夠更準(zhǔn)確、更快捷提供藥物在人體內(nèi)的有效性和毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，便于在第Ⅰ期人類臨床藥物試驗(yàn)前，將藥物安全性和有效性測(cè)試融合進(jìn)行。臨床志愿者因此而免于承擔(dān)無效藥物的副作用和安全風(fēng)險(xiǎn)，這將縮短臨床前試驗(yàn)與臨床試驗(yàn)的周期，大幅降低藥物開發(fā)投入[27]。因此，類器官技術(shù)作為一種全新的體外模型，將直接推動(dòng)藥物研發(fā)模式的新一輪變革。

       當(dāng)前，業(yè)界已建立起多種用于藥物篩選的類器官技術(shù)體系，并在藥物研發(fā)領(lǐng)域應(yīng)用進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段。譬如，科學(xué)家通過構(gòu)建多囊腎病類器官平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了囊腫形成抑制化合物的高通量篩選。癌癥藥物開發(fā)領(lǐng)域，已構(gòu)建起大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等多種癌癥的類器官庫，既保持腫瘤的異質(zhì)性，又較好展示腫瘤對(duì)藥物的敏感性。輝瑞、賽諾菲、阿斯利康等大型藥物企業(yè)在新藥研發(fā)中引入類器官技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)藥物研發(fā)流程優(yōu)化[26]。

       據(jù)報(bào)道，2015 年以來，全球類器官技術(shù)相關(guān)研究文獻(xiàn)和專利數(shù)量呈爆發(fā)式增長(zhǎng)。2010-2021年間，全球672 項(xiàng)類器官相關(guān)專利主要由中國(guó)、美國(guó)和韓國(guó)申報(bào)，其中79.46%屬類器官的構(gòu)建、制備和維持相關(guān)技術(shù)[26]。

       從肝類器官研究論文發(fā)表數(shù)量看，從2020年開始，論文的數(shù)量進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，且呈逐年遞增趨勢(shì)。2024年論文總數(shù)為711篇，2025年1-4月份發(fā)文總數(shù)達(dá)到214篇，幾乎相當(dāng)于2019年全年發(fā)文量（見圖3）。

二、類器官模型的主要類型

       目前已報(bào)道的“類器官”或與類器官相關(guān)體外三維細(xì)胞模型，大致可歸為以下7種類型[1]。

1）腸道類器官（intestinal organoid）

       腸道類器官可患者腸組織活檢（intestinal biopsies）分離的Lgr5+腸道干細(xì)胞(intestinal stem cells, ISCs)在體外培養(yǎng)擴(kuò)增形成。它具有腸隱窩（intestinal crypt）形狀的空心對(duì)稱球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有完整的腸道上皮結(jié)構(gòu)，含有包括腸上皮細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞(Paneth cell)和Lgr5+干細(xì)胞在內(nèi)成人腸道中發(fā)現(xiàn)的所有細(xì)胞類型[2]。

       目前的腸道類器類器官盡管可模擬體內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境下干細(xì)胞及其分化細(xì)胞的相互作用，但無法呈現(xiàn)器官組織損傷再生狀態(tài)下的變化。這是由于在真實(shí)體內(nèi)環(huán)境下組織損傷誘導(dǎo)的再生過程中，是由損傷態(tài)腸道干細(xì)胞來主導(dǎo)組織損傷修復(fù)過程。而如何穩(wěn)定地捕獲并維持損傷態(tài)干細(xì)胞亞群，是類器官研究及應(yīng)用面臨的重要挑戰(zhàn)。研究人員在常規(guī)小腸類器官模型基礎(chǔ)上，通過建立包含有VPA、EPZ6438、LDN193189 和 R-Spondin 1等8個(gè)小分子化合物組成的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)小腸類器官細(xì)胞損傷再生相關(guān)基因表達(dá)，并生成更復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，與體內(nèi)真實(shí)條件下腸道損傷再修復(fù)過程出現(xiàn)的“增生態(tài)”隱窩非常相似——增生態(tài)小腸類器官(hyperplastic intestinal organoids, Hyper-organoids)。Hyper類器官的擴(kuò)增能力得到極大增強(qiáng)：連續(xù)培養(yǎng)5代之后，小腸干細(xì)胞數(shù)量提升近10000倍，并在長(zhǎng)期傳代擴(kuò)增中保持基因組的穩(wěn)定性。這一新型類器官模型，解決了類器官技術(shù)在體外無法模擬損傷再生條件下器官和組織變化的難題，同時(shí)具備在體外高效擴(kuò)增和長(zhǎng)期維持的能力，為潰瘍性腸炎結(jié)腸上皮修復(fù)、建立疾病損傷模型和藥物篩選提供了新的途徑[28]。

2）神經(jīng)類器官(Neural organoid)

       患者來源的成纖維細(xì)胞[29]、淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系（Lymphoblastoid cell lines, LCL) ［30］或人外周血外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)［31］被重新編程后成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induce pluripotent stem cells, iPSCs)——誘導(dǎo)神經(jīng)元祖細(xì)胞（NPC）分化構(gòu)建的3D神經(jīng)類器官，可模擬人體腦神經(jīng)回路的結(jié)構(gòu)和功能、了解大腦發(fā)育或神經(jīng)發(fā)育過程，對(duì)于深入理解神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制以及開展藥物篩選和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)提供新的手段。因缺少有效人源性細(xì)胞模型，重性抑郁癥(MDD)患者自殺行為發(fā)生機(jī)制研究一致無法進(jìn)行。而利用攜帶患者來源的iPSCs分化為GABA能中間神經(jīng)元 (GABAergic interneurons, GINs) 和包含GIN的腹側(cè)前腦類器官進(jìn)行研究揭示了人類神經(jīng)元和腹側(cè)前腦類器官中MDD相關(guān)的重要細(xì)胞表型，為確定治療方法提供了新的思路。

3）腫瘤類器官(Tumor organoids)

       從患者腫瘤組織中分離的癌細(xì)胞體外擴(kuò)增生成的腫瘤類器官稱為患者來源腫瘤類器官（Patient-derived tumor organoids, PDTOs），具有與原始親代腫瘤近似一致的三維結(jié)構(gòu)、基因譜系和病理學(xué)特征，能較準(zhǔn)確地模擬腫瘤在體內(nèi)的微觀形態(tài)[32]，克服患者來源癌細(xì)胞(Patient-derived cancer cells, PDCs) 、患者來源腫瘤異種移植(patient-derived xenografts, PDXs)模型細(xì)胞多樣性不足的缺陷，可用于癌癥建模、個(gè)體化治療、腫瘤藥物篩選、腫瘤免疫治療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用[33]。

       自2011年首次成功構(gòu)建結(jié)直腸癌類器官以來，研究人員已經(jīng)構(gòu)建出前列腺、腸道、胃、肝臟、胰腺、乳腺、膀胱和大腦等多種高發(fā)病率、高死亡率人類腫瘤類器官并實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用[32]。膽囊癌(Gallbladder carcinoma, GBC) [34]等相對(duì)少見的惡性腫瘤模型也以陸續(xù)建立。有利于推動(dòng)惡性腫瘤的分子致病機(jī)制研究、發(fā)現(xiàn)腫瘤新治療靶點(diǎn)和個(gè)性化抗腫瘤化合物的開發(fā)。

4）類器官胚胎模型(Embryonic model)

       通過干細(xì)胞衍生的胚狀體和類器官并整合生物工程技術(shù)，科學(xué)家們能夠部分重現(xiàn)胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞譜系多樣化和組織形態(tài)發(fā)生的發(fā)育事件，包括長(zhǎng)距離組織模式和形態(tài)動(dòng)力學(xué)、組織間的相互作用，以及有機(jī)體級(jí)別的組織和功能[35]。

5）類器官芯片(Organoid-on-chip)

       類器官芯片發(fā)源于器官芯片（Organ-on-chip），同屬于微生理系統(tǒng)（Microphysiological System, MPS）范疇。微生理系統(tǒng)是一種體外構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，用于對(duì)人類、動(dòng)物的特定組織或器官功能特征進(jìn)行體外建模，可精細(xì)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境和微流體流動(dòng)條件，模擬組織器官的病理生理變化[36]。

       器官芯片則是專指在芯片上構(gòu)建的微生理系統(tǒng),是以工程化微流控裝置（microfluidic devices）為核心, 結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)等技術(shù)方法構(gòu)建的包含有多種活體細(xì)胞及功能組織界面、生物流體和機(jī)械力刺激等因素，可反映人體組織器官的主要結(jié)構(gòu)和功能特征的組織器官體外模型。最早開發(fā)的器官芯片為2010年創(chuàng)建的肺芯片，是一種載玻片大小的雙層夾膜結(jié)構(gòu), 一側(cè)用于氣流通過, 另一側(cè)用于培養(yǎng)液通過。中間多孔的PDMS膜兩側(cè)分別培養(yǎng)氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞, 從而達(dá)到模擬人體肺泡的氣液界面的效果。肺芯片的兩側(cè)以循環(huán)抽真空方式拉扯PDMS膜,使細(xì)胞受到類似肺牽張作用, 模擬肺泡呼吸的效果。平面2D培養(yǎng)細(xì)胞存在難以有效模擬組織器官在體生理特性的缺陷。因此，用體外3D培養(yǎng)的類器官替代器官芯片中傳統(tǒng)2D培養(yǎng)細(xì)胞就成為器官芯片技術(shù)進(jìn)步的必然選擇[37]。

       類器官芯片正是用三維(3D)細(xì)胞或類器官取代器官芯片中的二維(2D)細(xì)胞的方法推陳出新（相當(dāng)于舊瓶裝新酒）建立的新模型。采用嵌入水凝膠基質(zhì)中的HepG2和NIH-3T3細(xì)胞的共培養(yǎng)物形成肝臟類器開發(fā)的藥物篩選的微流控類器官芯片MODS，被成功用于不同濃度對(duì)乙酰氨基酚對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死影響的藥物早期肝毒性實(shí)驗(yàn)。研究顯示，HepG2細(xì)胞和NIH-3T3細(xì)胞在水凝膠3D環(huán)境下培養(yǎng)，表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞依賴性收縮行為，與同類2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，白蛋白分泌譜和細(xì)胞色素P450 3A4活性更能好地模擬體內(nèi)肝組織的功能狀態(tài)[38]。

       與常規(guī)基于超低吸附表面的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板實(shí)施的3D類器官培養(yǎng)模式比，類器官芯片依托微流控裝置構(gòu)建，流道、培養(yǎng)腔均為毫米尺度規(guī)格，可以控制單個(gè)細(xì)胞凝膠團(tuán)運(yùn)動(dòng)，可讓單個(gè)類器官的差異性研究成為可能，適合藥物濃度梯度實(shí)驗(yàn)和不同對(duì)照實(shí)驗(yàn)，不僅大幅節(jié)省實(shí)驗(yàn)過程類器官和試劑材料用量[23]。而一個(gè)芯片上將多個(gè)培養(yǎng)腔集成，則成倍提高實(shí)驗(yàn)通量。而微流控技術(shù)控制細(xì)胞培養(yǎng)基、氣體的輸送供應(yīng)，免除了類器官芯片的培養(yǎng)液定期更新的人工操作。最關(guān)鍵一點(diǎn)是，微流控控制模式，改善了傳統(tǒng)靜態(tài)類器官培養(yǎng)方式中營(yíng)養(yǎng)代謝物交換擴(kuò)散效率低下的問題，類器官隨時(shí)處于穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)條件中（正所謂：?jiǎn)柷牡们迦缭S，唯有源頭活水來）。

       此外，在單一類器官芯片基礎(chǔ)上，還可以將種類器官集成在一個(gè)芯片上，為設(shè)計(jì)開發(fā)多臟器類官芯片和人體仿真芯片成為可能[37]。

6）類器官組裝體(Assembloid)

       類器官組裝體是指將多個(gè)不同細(xì)胞類型構(gòu)成或組織類型的類器官置入同一個(gè)培養(yǎng)體系實(shí)施共同培養(yǎng)生成具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的復(fù)合型類器官，模擬體內(nèi)真實(shí)器官的組織結(jié)構(gòu)、發(fā)育特點(diǎn)。如一個(gè)腦類器官與一個(gè)肌肉類器官相連，以模擬肌肉組織的神經(jīng)支配(innervation)。以腸道和胃類器官耦合以模擬消化道(gastrointestinal tract)。
        人腦類器官組裝體是通過組裝兩個(gè)或更多腦區(qū)特異性類器官或?qū)⑵渌V系細(xì)胞整合到腦類器官中而成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，能夠反映器官與器官或器官與細(xì)胞的相互作用，模擬更復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育過程，作為研究神經(jīng)回路的結(jié)構(gòu)和功能的人源性模型，對(duì)深入理解神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制以及開展藥物篩選具有特殊價(jià)值[39]。研究人員用人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分別建立了大腦皮層、脊髓組織和骨骼肌的三種組織球體，以脊椎球體為中心將三種球體按皮質(zhì)-脊髓-骨骼肌順序相鄰排列在培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)后，三種球體逐漸融合并使自我精確組裝，衍生出含大腦皮層、脊髓和骨骼肌的3D 皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)組合體[40]。
       用低濃度膽紅素、抗壞血酸處理未成熟的類器官生成GLUL+肝細(xì)胞Z3-HLOs、CPS1+肝細(xì)胞的Z1-HLOs，將Z3-HLO和Z1-HLOs類器官按數(shù)量1:2的比例共培養(yǎng)生成帶有三個(gè)細(xì)胞區(qū)帶特征的組合式多區(qū)域人肝臟類器官(mZ-HLOs) [12]。

7）類器官異種嵌合體(interspecies Chimera)

       類器官嵌合體是將一個(gè)物種細(xì)胞生成的類器官人工植入到異種動(dòng)物體內(nèi)的研究模型。如將體外培養(yǎng)生成的人類器官移植到動(dòng)物體內(nèi)，以在模擬類器官生長(zhǎng)發(fā)育依賴的組織微環(huán)境條件，以促進(jìn)其進(jìn)一步發(fā)育和生理整合，改善血管化形成和類器官的成熟度(maturation)。2022 年，研究人員突破性地實(shí)現(xiàn)了人類大腦類器官與大鼠大腦的連接，使得人類神經(jīng)元與大鼠神經(jīng)元的突觸建立連接，并控制大鼠的行為[41]。在此基礎(chǔ)上，將人腦類器官植入視覺皮質(zhì)受損的大鼠腦部，不僅成功實(shí)現(xiàn)了人- 鼠腦的整合，并對(duì)視覺刺激產(chǎn)生反應(yīng)，邁出了利用腦類器官修復(fù)受損大腦的第一步[42]。

       通過多能干細(xì)胞注射進(jìn)行囊胚互補(bǔ)被認(rèn)為是產(chǎn)生異種器官的最有前途的方法。但倫理規(guī)范限制了對(duì)胚胎發(fā)育晚期人類嵌合體的研究。靈長(zhǎng)類動(dòng)物胚胎干細(xì)胞具有與人ESC相似的多能性，是研究種間嵌合體和器官生成的良好模型。但靈長(zhǎng)類動(dòng)物ESC是否可用于異源性移植不清楚。中國(guó)科學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)采用一種優(yōu)化的培養(yǎng)基，增強(qiáng)了食蟹猴 （Macaca fascicularis） 胚胎干細(xì)胞（cmESCs）的抗凋亡能力并改善了嵌合胚胎的發(fā)育，將馴化的食蟹猴（Macaca fascicularis）胚胎干細(xì)胞（cmESCs）注射到豬囊胚中所得的嵌合胚胎后，可分化成全部三個(gè)胚層的細(xì)胞。并在所得的新生異種間嵌合體觀察到組織特異性cmESCs分化，表明cmESCs能夠在豬模型中整合和分化為功能細(xì)胞。因此，類器官異種嵌合體展現(xiàn)了通過種間囊胚互補(bǔ)在大型動(dòng)物模型中產(chǎn)生人體組織器官的技術(shù)可行性和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展應(yīng)用的前景[43]。

三、類器官技術(shù)研究應(yīng)用目前面臨的主要困境

       盛名之下，其實(shí)難副。盡管類器官的研究和開發(fā)應(yīng)用目前在科研和制藥界如今可謂炙手可熱，但類器官技術(shù)體系尚未完全成熟[25, 26, 32]。拋開構(gòu)建類器官或類器官芯片的細(xì)胞來源、具體目標(biāo)器官類型（組織類器官\類器官芯片\多器官芯片）、研究目的（基礎(chǔ)研究\臨床前研究\臨床應(yīng)用研究\生物生產(chǎn)）和類器官技術(shù)應(yīng)用所涉及的倫理問題，還存在多個(gè)難題有待突破。

3.1 目前多數(shù)類器官對(duì)靶器官的還原程度還不夠高

       在體的器官均是各種細(xì)胞類型的集合體，細(xì)胞與周圍微環(huán)境之間存在多向相互作用，參與組織形成、維持穩(wěn)態(tài)和功能穩(wěn)定。而類器官培養(yǎng)體系中微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞成分缺乏，類器官缺少有效的神經(jīng)支配、毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)及相應(yīng)的血管循環(huán)結(jié)構(gòu)、免疫微環(huán)境，則難以完全重現(xiàn)各種器官的整體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成、真實(shí)器官所處生理環(huán)境和一些重要的生理過程[1]。常規(guī)類器官靜態(tài)培養(yǎng)體系中，由于缺乏功能性循環(huán)系統(tǒng)，物質(zhì)交換完全依賴物質(zhì)在培養(yǎng)基質(zhì)中的被動(dòng)擴(kuò)散而效率低下。隨著類器官體積快速增長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣向中心區(qū)域的擴(kuò)散能力逐漸下降，中央?yún)^(qū)域細(xì)胞因物質(zhì)交換不良而出現(xiàn)細(xì)胞壞死[26]。在1-3個(gè)月的類器官培養(yǎng)過程中，每2 – 3天需更換培養(yǎng)基、每5 – 7日安需傳代1 次。盡管耗費(fèi)大量人力實(shí)驗(yàn)材料，類器官內(nèi)細(xì)胞的活力依然不足，類器官體積受限（大部分類器官尺寸為微米至毫米級(jí)，腫瘤類器官直徑通常為100 ~ 500μm，3D懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的腦類器官球體可以達(dá)到3-4mm直徑），限制了類器官的結(jié)構(gòu)與功能完整性、發(fā)育成熟度和類器官培養(yǎng)傳代的穩(wěn)定性[25,26]。

       為此，在大腦皮層類器官研究中，開發(fā)了切片新皮質(zhì)類器官系統(tǒng)（sliced neocortical organoid system, SNO），將類器官置于帶抗CO2振蕩搖床的CO2培養(yǎng)箱或旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，并與類器官切片方法相結(jié)合，以克服培養(yǎng)基物質(zhì)交換擴(kuò)散極限，SNO培養(yǎng)系統(tǒng)中的類器官可以維持長(zhǎng)達(dá)一年，極大地促進(jìn)大腦皮質(zhì)類器官發(fā)育，特別適合人腦皮質(zhì)發(fā)育和精神疾病中調(diào)節(jié)人類皮層神經(jīng)元亞型命運(yùn)的分子機(jī)制的研究[44]。

       而針對(duì)常規(guī)CO2靜態(tài)培養(yǎng)條件體系中，采用多種細(xì)胞成分共培養(yǎng)的方法以重構(gòu)體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境是較為流行的策略。如類器官與血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）共培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)類器官血管化，可復(fù)制出與真實(shí)器官高度相似的內(nèi)部環(huán)境。在超低吸附培養(yǎng)板中將血管內(nèi)皮細(xì)胞、多能干細(xì)胞以及多能干細(xì)胞來源的肝內(nèi)胚層細(xì)胞共培養(yǎng)，成功生成了具有自發(fā)血管網(wǎng)絡(luò)的肝臟類器官，能更真實(shí)地反映肝臟類器官的發(fā)育或病理狀態(tài)，為研究肝臟生理功能和疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新途徑[45]。子宮內(nèi)膜是一種多細(xì)胞組織，它包括構(gòu)成子宮內(nèi)膜表面的單層柱狀上皮細(xì)胞和位于腔上皮下方的管狀腺上皮組成。缺乏具有典型腔上皮樣結(jié)構(gòu)以及與體內(nèi)子宮內(nèi)膜解剖結(jié)構(gòu)類似的體外模型，是深入研究不孕癥和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜疾病等疾病的最大障礙。研究人員首先通過一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的最佳比例，并改善了培養(yǎng)類器官的細(xì)胞外基質(zhì)，使之物理硬度及生理環(huán)境更利于子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，用氣液界面培養(yǎng)方法（模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜腔面僅被黏液層覆蓋的上皮結(jié)構(gòu)的特殊體內(nèi)環(huán)境），最終形成包含腔上皮、腺上皮及基質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)膜類器官，準(zhǔn)確再現(xiàn)了體內(nèi)子宮內(nèi)膜的細(xì)胞組成、解剖結(jié)構(gòu)和月經(jīng)周期性變化等特征^[18] 。

3.2 類器官培養(yǎng)存在對(duì)非人源成分細(xì)胞外基質(zhì)過度依賴的瓶頸

       類Matrigel基質(zhì)膠是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜混合物。在室溫條件下，Matrigel聚合成具有一定孔隙和剛性的三維基質(zhì)，可模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的組成結(jié)構(gòu)、物理特性，為細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移提供機(jī)械支持，并介導(dǎo)細(xì)胞的遷移、定位、極化和信號(hào)傳導(dǎo)。目前，包括結(jié)腸、胃、肝臟和胰腺等大多數(shù)類器官的培養(yǎng)都依賴于Matrigel水凝膠基質(zhì)進(jìn)行。Matrigel固然有多功能性和可負(fù)擔(dān)性優(yōu)勢(shì)，但成份極其復(fù)雜，含有包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，和TGF-?、表皮生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子等多種生長(zhǎng)因子，蛋白質(zhì)的種數(shù)超過1800種。過于復(fù)雜的組份造成制品組成的批次間差異和類器官培養(yǎng)體系不穩(wěn)定，導(dǎo)致培養(yǎng)的類器官存在較大批次間差異，不利于類器官標(biāo)準(zhǔn)化穩(wěn)定生產(chǎn)質(zhì)量[46-49]。目前看，類器官培養(yǎng)中的Matrigel過度依賴給類器官生成過程質(zhì)控管理造成的困難還只是一方面。Matrigel的使用還有更關(guān)鍵的問題值得關(guān)注。
       首先是Matrigel性能還不夠理想，不應(yīng)視作類器官培養(yǎng)的“萬金油”。因Matrigel凝膠主要是腫瘤ECM成分，如層粘連蛋白，通常在幾種腫瘤組織中高度表達(dá)。而腫瘤ECM成份與其它正常組織的基質(zhì)體大不相同，Matrigel可能缺少形成特定類器官所需分化信號(hào)成分。腫瘤 ECM 的基質(zhì)膠無法為腸道類器官類器官提供組織特異性微環(huán)境[46]。據(jù)報(bào)道，由于層粘連蛋白-511的數(shù)量不足及缺乏間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cells)等其他細(xì)胞，在Matrigel培養(yǎng)的腸道類器官缺乏哺乳動(dòng)物腸道的一些特征性結(jié)構(gòu)。此外，Matrigel凝膠形成的支持介質(zhì)在彈性、孔徑和蠕變方面的機(jī)械性能存在異質(zhì)性[48]。
       Matrigel還存在適用范圍的限制問題。因源自成熟組織活檢材料衍生的上皮類器官往往具有成熟組織的病理生理狀態(tài)特征，故它與誘導(dǎo)iPSC來源類器官擴(kuò)增和分化培養(yǎng)基要求有所差別。這對(duì)使用成熟組織來源的上皮類器官作為藥物開發(fā)模型形成障礙。Matrigel源于腫瘤細(xì)胞，其潛在免疫原性和病原體轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，質(zhì)量品質(zhì)可追溯性、GMP生產(chǎn)對(duì)腫瘤衍生材料安全性限制要求，使得Matrigel培養(yǎng)的類器官難以在患者特異性靶向免疫細(xì)胞人類臨床植入療法、藥物開發(fā)中的有效應(yīng)用[46,48,49]。
       Matrigel性能、適用性的局限性，推動(dòng)了使用聚合物（如聚乙二醇、納米纖維素、藻酸鹽、透明質(zhì)酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物）等水凝膠基質(zhì)、組成成分明確、物理化學(xué)特性可控和可重復(fù)批次制備的人工合成或半合成ECM替代品的開發(fā)。與動(dòng)物來源的 Matrigel 相比，新型聚合物ECM，可以根據(jù)需要控制各種生物物理特性（合成聚合物的含水量、孔隙率、剛度和剛度）和生物分子的添加，合成更高效，消除了內(nèi)毒素和炎癥蛋白等干擾類器官的生長(zhǎng)和可重復(fù)性[50]。這種合成 ECM 在支持來自多個(gè)不同供體以及腸道和子宮內(nèi)膜的人類類器官培養(yǎng)，還可能推廣至其他上皮類器官培養(yǎng)[49]。
       基于聚合物聚異氰肽 (polyisocyanopeptides, PIC)和層粘連蛋白(laminin)的新型水凝膠，具有熱敏特性，易于處理。在肝類器官培養(yǎng)中，與使用 Matrigel相當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖塑料，可有效地分化為具有關(guān)鍵肝功能的肝細(xì)胞樣表型。這種增殖和分化至少維持 14 次傳代。表明，PIC 在人類肝臟類器官培養(yǎng)方面非常有前途。在胃腸道組織來源的細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠（gastrointestinal tissue-derived extracellular matrix hydrogels）中生長(zhǎng)的胃或腸道類器官的發(fā)育和功能與 Matrigel 中的類器官相當(dāng)或通常優(yōu)于Matrigel。此外，通過提供胃腸道組織模擬微環(huán)境實(shí)現(xiàn)了類器官的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)和移植。當(dāng)前金標(biāo)準(zhǔn) Matrigel 的有效替代品，并產(chǎn)生適用于胃腸道疾病建模、藥物開發(fā)和組織再生的類器官。
       目前，人工合成ECM水凝膠還需改進(jìn)以完全重建天然組織的ECM環(huán)境組成并促進(jìn)類器官發(fā)育和成熟[46]。同時(shí)，種類較少，適用范圍較單一，尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化。

3.3 最重要的是類器官構(gòu)建技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系不完善

       作為近10年來生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)最熱門的前沿技術(shù)之一，類器官技術(shù)研究應(yīng)用進(jìn)展迅猛，人體多個(gè)器官均有其類器官的建立及應(yīng)用的報(bào)道。

類器官構(gòu)建操作流程涉及到組織樣本前處理、原代細(xì)胞分離培養(yǎng)、干細(xì)胞重編程誘導(dǎo)、干細(xì)胞的分化培養(yǎng)、3D類器官培養(yǎng)、類器官傳代擴(kuò)增、低溫貯藏與復(fù)蘇等多個(gè)環(huán)節(jié)[51]。為確保產(chǎn)出的類器官模型的穩(wěn)健性，從原代細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和最終生成類器官，過程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)需進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)量控制。最終生成的類器官，從形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能活性檢測(cè)到表型表征分析。

       不同組織細(xì)胞來源的類器官（如肝臟、腸道、心臟等），培養(yǎng)方法等存在差異。目前，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室條件下的類器官的培養(yǎng)主要依賴于主觀經(jīng)驗(yàn)和手工操作。諸如培養(yǎng)基和組成和更新頻次、傳代培養(yǎng)時(shí)機(jī)的把握、誘導(dǎo)分化過程中添加生長(zhǎng)因子的種類和時(shí)機(jī)控制等，不同實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的類器官模型間會(huì)存在差異。

       類器官雖能保留親本組織的遺傳特征和生物學(xué)功能，但長(zhǎng)期傳代、冷凍保存和復(fù)蘇再培養(yǎng)對(duì)不同組織細(xì)胞分子特性的影響尚不十分明確。不同組織細(xì)胞誘導(dǎo)條件下的多能干細(xì)胞及所生成的類器官穩(wěn)健性不一，而對(duì)生成類器官所用的多能干細(xì)胞傳代代數(shù)目前并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

       與相對(duì)應(yīng)的器官擁有類似的空間組織并能夠重現(xiàn)對(duì)應(yīng)器官的部分功能。選擇能準(zhǔn)確反映類器官質(zhì)量和功能的指標(biāo)，以確定類器官在多大程度上還原了體內(nèi)器官真實(shí)情況，并據(jù)此作為類器官質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，仍充滿挑戰(zhàn)性。一是因?yàn)椴煌N類的類器官功能不同，表征其結(jié)構(gòu)、功能活性、生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法與指標(biāo)不同。二是不同實(shí)驗(yàn)室硬件資源配置不一，可利用的硬件條件參差不齊，給制定統(tǒng)一的類器官表征標(biāo)準(zhǔn)帶來困難。

四、對(duì)類器官技術(shù)研究認(rèn)識(shí)的誤區(qū)

       類器官技術(shù)研究和應(yīng)用目前正處于技術(shù)爆發(fā)階段的階段。研究成果報(bào)道及商業(yè)化應(yīng)用宣傳信息撲面而來，很容易讓人陷入信息繭房。就我們所掌握的資料看，關(guān)于類器官技術(shù)研究應(yīng)該避免以下認(rèn)知誤區(qū)。

       誤區(qū)1：類器官即人體類器官。

       事實(shí)上，目前公開實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，衍生類器官所用初始組織細(xì)胞材料或構(gòu)建成類器官，有相當(dāng)部分項(xiàng)目，特別是與胚胎發(fā)育有關(guān)的應(yīng)用，都與嚙齒類動(dòng)物、家畜和靈長(zhǎng)類動(dòng)物等類器官有關(guān)[43,52-54]。

       誤區(qū)2：類器官芯片先進(jìn)論。

       須知，類器官模型芯片化主要目的之一是解決新藥篩選對(duì)高通量的需求問題。并非所有組織細(xì)胞、類器官模型都已商品化，通過購(gòu)買即可立即啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)。以再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用為目標(biāo)的類器官研究，就難以通過類器官芯片的技術(shù)路線來實(shí)現(xiàn)。相反，目前大量公開報(bào)道中，無論是論文數(shù)量和文章質(zhì)量和影響力，居支配地位的并非類器官芯片。

       誤區(qū)3：類器官自動(dòng)化工作站萬能論。

       類器官自動(dòng)化工作站是集成了CO2培養(yǎng)環(huán)境控制模塊、自動(dòng)移液工作站、自動(dòng)微孔板機(jī)械臂和倒置顯微成像系統(tǒng)的一體式自動(dòng)控制系統(tǒng)，通過個(gè)性化編程或基于預(yù)置應(yīng)用協(xié)議，可實(shí)現(xiàn)從多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)期間自動(dòng)移液和培養(yǎng)基更新、維持穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，到微孔板細(xì)胞載體內(nèi)類器官定期成像監(jiān)測(cè)與分析全流程的自動(dòng)實(shí)施。核心優(yōu)勢(shì)是能執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化的類器官培養(yǎng)協(xié)議，將實(shí)驗(yàn)人員從繁重操作中解放而可以把主要精力集中在實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)與方案優(yōu)化設(shè)計(jì)上。特別適合藥物研發(fā)場(chǎng)景下測(cè)試目標(biāo)較固定、實(shí)驗(yàn)方案標(biāo)準(zhǔn)化、有通量與效率要求的單線程實(shí)驗(yàn)。
        類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)動(dòng)輒數(shù)周甚至數(shù)月，自動(dòng)工作站既不能縮短培養(yǎng)時(shí)間，也難以滿足多個(gè)不同類型類器官共享一套系統(tǒng)同步的培養(yǎng)要求。因此，單一臺(tái)套工作站實(shí)驗(yàn)任務(wù)預(yù)約接待量十分有限。
        而類器官實(shí)驗(yàn)初學(xué)者，在類器官實(shí)驗(yàn)流程引進(jìn)、復(fù)制成功并標(biāo)準(zhǔn)化前，依靠工作站提供的極其有限的應(yīng)用協(xié)議基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)流程編程優(yōu)化絕非易事，寄希望于自動(dòng)化工作站實(shí)現(xiàn)walk-away傻瓜式工作，恐難如愿。

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